加熱塊均勻性分析

作者：文/ Andrew Birnie 本文作者供職於(yu) PCRmax公司。 文章來源：PROCESS製藥網 《製藥業(ye) 》 發布時間：2015-12-10

圖 1 qPCR空心銀塊示意圖 (Eco 48 PCRmax)。該創新硬件具有穩健的熱性能，能夠加速 qPCR 操作規程

新一代測序技術(NGS)憑借的數據吞吐率、可擴展性和速度使得研究人員能夠以的水平研究生物係統。現如今，基因組研究問題越來越複雜，除了傳(chuan) 統的DNA測序技術外，迫切需要更深入的信息支持。新一代測序技術地彌補了這一空缺，成為(wei) 解決(jue) 轉譯研究領域諸多問題的日常研究工具，例如臨(lin) 床診斷、農(nong) 業(ye) 基因組以及法醫學。

但是這同時也是挑戰。NGS 運行每失敗一次都將給實驗室帶來巨大的損失，事實上有時候造成的損失可以高達3000美元。

為(wei) 了確保測序技術的成本效益並精簡流程提高準確性，實驗室需要確保不會(hui) 讓缺乏性和均勻性的qPCR技術對運行造成破壞。這可能與(yu) 所使用的儀(yi) 器有很大關(guan) 係。每一PCR係統中的多種因素，從(cong) 溫度控製到光滲透，都會(hui) 對每次運行的可靠性產(chan) 生影響。通過實現*均勻性，製造商能夠確保每次運行*可靠且準確。

為(wei) 了確保可靠性和準確性，商用儀(yi) 器中也逐步采用創新型新技術。本文將介紹這些儀(yi) 器(例如Eco 48實時PCR係統，PCRmax)如何在加熱塊中實現*的均勻性，以及其可靠性等級在工作實驗室範圍內(nei) 產(chan) 生的影響。

圖 2顯示所有 48 個(ge) 孔板數據的基線校正擴增圖。數據分析顯示平均 Cq 為(wei) 13.31，標準偏差為(wei) ±0.061，而整個(ge) 孔板的 %CV 僅(jin) 為(wei) 0.46%，表示精度非常高

提高NGS技術性能

的DNA擴增是基因組研究的基本追求。同時，高吞吐率 NGS技術的研發也通常被視為(wei) 過去30年生物科學領域革命性的創新之一。如今這一強度的技術已經取代了以桑格測序為(wei) 行業(ye) 標準的傳(chuan) 統PCR技術，例如毛細管和凝膠技術。

NGS技術能夠使研究人員同時處理百萬(wan) 條多量級的平行 DNA 序列，速度比傳(chuan) 統測序技術更快。但是NGS的成本依然很高;一套商用NGS係統的價(jia) 格大約在15萬(wan) ~100萬(wan) 美元之間，同時驅動這些流程的成本也非常高。因此，方法研製的關(guan) 鍵便在於(yu) 優(you) 化每次運行的條件，將故障風險降至zui低，實現zui大化。目標庫定量已被視為(wei) 能夠利用成本有效性技術從(cong) 而簡化NGS工作流的領域。

NGS流程需要製備目標庫，並且在該庫中靶分子片段將與(yu) 銜接子相融合，隨後通過聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增和測序。zui終庫中目的DNA片段的大小將成為(wei) 構建NGS庫的關(guan) 鍵參數。如果 NGS平台上加載的模板過少，運行的效率將非常低。如果平台上加載的模板過多，那麽(me) 不僅(jin) 會(hui) 導致效率低下，還會(hui) 增加*失效的可能性。因此穩健且可靠的庫定量非常關(guan) 鍵。

圖 3顯示孔板中 48 個(ge) 孔數據的標稱熔點曲線。100bp PCR 產(chan) 物在 75~95 ℃ 範圍內(nei) 熔化，Eco 48以0.1 ℃的溫度變化測量熒光性，IV 級 SNP 的檢測精度需要超過 99%

定量PCR(qPCR)是NGS庫定量可選的技術之一。但是，並不是所有的PCR係統均能夠帶來足夠的熱均勻性，滿足NGS係統安全加載所需的高重複性和度。此外，冗長的qPCR操作規程會(hui) 嚴(yan) 重影響整個(ge) NGS運行的效率。由於(yu) 一次失敗運行所損失的成本超過了高性能qPCR儀(yi) 器的價(jia) 格，因此采用穩健的定量qPCR技術被視為(wei) 實現一致NGS的zui簡單且成本效益的方式之一。

圖 4(A和 B)：孔板48個(ge) 孔的Cq和Tm數據概覽。所有48個(ge) 樣本的記錄zui大變化為(wei) 0.24個(ge) 周期，整個(ge) 孔板的Tmzui大範圍為(wei) 0.2 ℃(84.3~84.5 ℃)

選擇正確的 PCR 技術

qPCR可以監控退火流程期間熒光引物的排放物，從(cong) 而可以監控鏈擴增。為(wei) 了在適當的反應階段進行定量分析，將實時捕獲熒光信號。這可以克服傳(chuan) 統、半定量端點檢測產(chan) 生的相關(guan) 不性，包括樣本之間PCR效率的不明變化以及回推起始量時產(chan) 生的誤差。

溫度控製是qPCR技術的核心所在;其將決(jue) 定引物能否有效結合以及聚合酶能否起到*效果。為(wei) 了實現高準確度，實時 PCR熱係統必須確保整個(ge) 加熱快的溫度均勻性，確保能夠以相同速率的反應處理所有的樣本。但是，標準qPCR係統在50~60 ℃溫度範圍內(nei) 的熱準確性隻有大約 ±0.5 ℃。通常這不足以地定義(yi) 聚類密度，並且如果qPCR平台低於(yu) 或超過實際庫濃度時，NGS 運行可能會(hui) 麵臨(lin) 故障風險。對於(yu) qPCR實驗，嚴(yan) 格的MIQE(定量實時PCR試驗發布的zui低限度的信息)指南強調了精度的重要性，需要采用靈敏度更高的qPCR技術。

傳(chuan) 統qPCR係統采用珀耳帖熱保溫塊來驅動熱循環。加熱這些實心塊的整個(ge) 表麵數據能量密集型流程。在平衡至穩定時期之前，大多數基於(yu) 珀爾貼的係統會(hui) 超過所需的反應溫度。加熱塊範圍內(nei) 所有孔達到該點所需的時間將延長運行時間。更重要的是，這種加熱方法會(hui) 導致較高的熱不均勻性(TNU)，數值為(wei) ±0.5 ℃，並導致較差的升溫斜率。不準確和效率低導致傳(chuan) 統的實心塊qPCR 無法適用於(yu) 高性能應用。

qPCR加熱技術的發展克服了上述難題。現代係統利用*均勻的空心銀塊，其中將流經導電流體(ti) 。使用單一的珀爾貼設備來加熱和冷卻流體(ti) ，隨後流體(ti) 通過反向攪拌器將在所有的樣本孔中均勻循環。這可以確保穩健的熱性能，使得95 ℃條件下的 TNU值低於(yu) ±0.1 ℃，從(cong) 而可以縮短運行時間。使用該係統的標 40循環PCR操作規程大約需要40 min的時間才能完成，而優(you) 化後的流程隻需要15 min的時間便可完成。

熒光監測技術取得的發展改善了qPCR技術的性能。高性能光學係統使得能夠在一次反應中實時監測多達四種目標物，並且先進的探測器陣列能夠監控源自所有孔的熒光，允許係統記錄每個(ge) 孔、過濾器和周期，不會(hui) 遺漏任一數據點。zui終，利用穩定的發光二極管(LED)幫助生成準確的數據，可以延長儀(yi) 器使用壽命，降低折舊成本。

下列案例研究說明了加熱塊熱均勻性的改善是如何帶來高性能NGS應用所需的靈敏度、精度和整體(ti) 效率。

案例研究：提高 qPCR 精度

48個(ge) 複製樣本通過PCRmax Eco48進行高分辨率熔解(HRM) 操作。HRM 確保能夠對遺傳(chuan) 變異進行準確地分析，例如量化單核苷酸多態性(SNP)，就精度而言是需熱量zui大的操作規程之一。

48個(ge) 樣本孔中的每一個(ge) 都注滿了 1×10 8個(ge) 起始模板的副本，zui終體(ti) 積為(wei) 10 ul。孔板進行了密封，並在12 000 rpm 條件下進行離心分離1 min，未優(you) 化40循環 PCR 操作規程的總體(ti) 完成時間為(wei) 43min。使用源自 Promega 的 GoTaq® QPCR GoTaq® QPCR Master Mix (2x)(產(chan) 品代碼 A6001)對模板進行擴增處理，用於(yu) 40次循環。在60 ℃操作結束時將收集熒光光譜數據。使用生態研究軟件分析結果，以確定定量循環 (Cq)、熒光檢測點以及48個(ge) 複製品中每一個(ge) 的解鏈溫度 (Tm) 值。

圖 2 顯示了所有 48 個(ge) 孔的基線校正擴增圖譜。該圖清晰展示了整個(ge) 孔板的擴增精度。數據分析顯示平均 Cq 為(wei) 13.31，標準偏差為(wei) ±0.061。這意味著整個(ge) 孔板的變異係數 (%CV) 僅(jin) 為(wei) 0.46%，表示精度非常高。 PCR產(chan) 物擴增後運行熔化階段，借此來確定 Tm，而Tm是確定加熱塊均勻性zui有效的衡量標準之一。擴增產(chan) 物在75~95℃範圍內(nei) 熔化，Eco 48以0.1℃的溫度變化為(wei) 變量來測量熒光性， IV級 SNP的檢測精度需要超過 99%。圖 3 顯示了標稱熔點曲線。所有 48個(ge) 孔板的平均 Tm 為(wei) 84.45℃，標準偏差為(wei) ±0.058，相當於(yu) 整個(ge) 孔板的%CV 僅(jin) 為(wei) 0.07%。這說明加熱塊的溫度均勻性非常*。圖4A和4B概述了該實驗的結果。

推動基因組學未來發展

采用熱準確性的係統能夠提高所有PCR應用的分析生產(chan) 率。但是，人們(men) 越來越認為(wei) 更大程度的溫度控製會(hui) 給用戶在NGS 流程期間造成更大的成本，這就使得高性能qPCR成為(wei) 例行測序的關(guan) 鍵特點。采用創新加熱塊技術的qPCR儀(yi) 器，例如PCRmax Eco 48，可以在40  min內(nei) 完成熱均勻性和快速循環，每次溫度變化後，整個(ge) 加熱塊立即會(hui) 發生±0.1℃ 的均勻性變化。