病原微生物的檢測是感染類疾病的診斷治療中*的重要環節。

      傳(chuan) 統的病原微生物檢測方法分為(wei) 培養(yang) 和非培養(yang) 兩(liang) 類，臨(lin) 床*的金標準是分離培養(yang) 和生化鑒定，這種方法的操作周期長、失敗率高，並且不是每種病原體(ti) 都可以培養(yang) 。相比之下，不依賴培養(yang) 的鏡檢、抗體(ti) 抗原免疫等方法，在采樣當天即可報告結果。這些方法的時效性強，但在準確性上存在明顯劣勢。

      近年來，基於(yu) 核酸檢測的分子診斷技術發展迅速。基於(yu) PCR的方法直接從(cong) 樣本中識別微生物可以加速鑒定，但這些測試僅(jin) 包括少量病原體(ti) ，在選擇測試之前需要進行推定診斷，仍然不能滿足的臨(lin) 床需要。

然而，大量的重症感染病例由於(yu) 不能得到及時的診斷和治療而延誤病情，造成不可挽回的嚴(yan) 重後果。如何才能實現快速，高效，精準，無創，廣譜定性的病原檢測已成為(wei) 臨(lin) 床醫學追求的目標。

      cfDNA檢測技術讓這一希望得以實現：這種非侵入性診斷技術目前在在胎兒(er) 異常診斷、移植器官排異檢測及癌症的表征及檢測中已得到大量應用，而在病原感染檢測中，cfDNA檢測技術可以實現血漿中不同位置感染的病原體(ti) DNA的片段檢測，實現無創檢測多種感染的可能。

      膿毒症，一種因感染導致組織和器官損傷(shang) ，進而造成的全身性炎症反應。每年有近3000萬(wan) 人會(hui) 感染此類疾病，其中超過1800萬(wan) 為(wei) 嚴(yan) 重病例，800萬(wan) 人會(hui) 因此喪(sang) 生。早期的發現和適當的治療在膿毒症預防和控製方麵意義(yi) 重大。

   2019年，著名學術期刊《Nature microbiology》報道了一例利用cfDNA技術檢測膿毒症病原的實例，工作流程如下圖：

     基於(yu) 此技術，病原微生物的臨(lin) 床可報告範圍（CRR）有了極大拓展，可包括（1）DNA病毒，可培養(yang) 細菌，其他條件苛刻和不可培養(yang) 的細菌，分枝杆菌，文獻中的真核病原體(ti) ；（2）在已發表的病例報告中引用的病原體(ti) 數據庫；（3）從(cong) 臨(lin) 床分離測序獲得的參考基因組以及已報道的致病性病原。

     這其中，快速精準以及低微核酸起始量（10pg-100ng）的測序文庫構建，得益於(yu) Tecan*的Ovation Ultralow Library System V2 文庫構建技術，該技術廣泛適用於(yu) 各種類型的核酸樣本建庫，尤其在麵對cfDNA檢測的超低起始量時表現良好，並能在3小時內(nei) 完成簡單，自動化的建庫過程，並能應對各種GC含量的高保真擴增。技術路線如下：

Ovation Ultralow Library System V2可應用於(yu) 各種類型的測序研究，包括：全基因組測序、外顯子測序、ChIP-seq、微生物組研究，液態活檢，石蠟包埋樣本（FFPE）等。建庫過程中不會(hui) 產(chan) 生接頭二聚體(ti) （見下圖，與(yu) 競品的比較）。

效果穩定，不受核酸起始量影響：

在GC含量的樣本中也能有穩定出色的表現：

在《Nature microbiology》的膿毒症cfDNA病原檢測研究中，Ovation Ultralow Library System V2大放異彩。研究中利用350名敗血症患者，166份未發現明確膿毒症的樣本開展cfDNA的提取，運用二代測序檢測技術，鑒別並定量血液中1250種與(yu) 臨(lin) 床相關(guan) 的細菌、DNA病毒、真菌和真核寄生蟲，可利用血液中遊離微生物DNA（cfDNA），準確、快速地診斷多種感染。

研究中的cfDNA病原微生物檢測，可以實現高度敏感（靈敏度LoD &小檢測量 LoQ）的病原微生物檢測,廣譜病原檢測可報告範圍使cfDNA病原檢測技術具有更廣泛的敏感性：在不用含量血漿DNA檢測中均有出色表現，結合臨(lin) 床驗證，125次模擬中有121次正確檢測，靈敏度達97%：陽性預a-c測值（Ppv）達99%，與(yu) 預測的95%高度一致（圖a-c）；

      該技術可實現病原的精準檢測，在實驗模型中進行檢測精準度研究發現，快速檢驗測試中的重複測量，個(ge) 體(ti) 微生物的平均變異係數為(wei) 21.1%（±13.6%），與(yu) 實驗室內(nei) 的檢測精密度相當。

      由於(yu) 個(ge) 體(ti) 間cfDNA中病原成分的差異，在使用臨(lin) 床樣本時難以準確區分cfDNA中低水平存在的環境汙染DNA。所以研究利用重複測量評估了這種方法檢測的分析特異性（下圖）。在被測試的50件複製品中，意外的微生物cfDNA僅(jin) 在一次複製中檢出，總特異性為(wei) 98%；以不同比例混入混入菌株檢測，檢測值與(yu) 預期也保有良好一致性，同時證實了密切相關(guan) 物種共感染造成的幹擾極低。

     為(wei) 了評價(jia) 血漿來源的微生物cfdna作為(wei) 廣泛感染病原體(ti) 的生物標誌物的有效性，研究亦將微生物cfDNA測序結果與(yu) 病原體(ti) 鑒定結果進行了比較（下圖）。與(yu) 原血培養(yang) 相比，cfDNA技術敏感度可達93.7%，同時cfDNA技術提供了物種級鑒定的靈敏度和速度。

       血液遊離微生物DNA測序，有望作為(wei) 非侵入性檢測方法用於(yu) 感染疾病檢測。而快速高效高靈敏精準的建庫技術則是臨(lin) 床病原體(ti) 檢測診斷的核心。Ovation Ultralow Library System V2技術，完美將快速建庫，低核酸起始量背景，高精準測量要求整合，滿足了多種研究和樣本類型的建庫要求，為(wei) 科學研究及臨(lin) 床醫學應用提供了強有力的技術支撐。

參考文獻：

Analytical and clinical validation of a microbial cell-free DNA sequencing test for infectious disease. Nature microbiology,2019.