2019年12月開始的新型冠狀病毒肺炎（NCP）正在國內(nei) 大規模流行，成為(wei) 影響全社會(hui) 的公共衛生事件。國內(nei) 的科研機構迅速行動，在短時間內(nei) 獲得了新型冠狀病毒（2019-nCoV）的全基因組序列。無論是從(cong) 治療的角度還是從(cong) 流行病學的角度來說，對於(yu) 疑似病例的診斷都有著極其重要的意義(yi) 。

來自武漢和廣州的研究人員報道了他們(men) 用高通量測序技術（NGS）從(cong) 2名武漢大學中南醫院疑似患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）中鑒定2019-nCoV的過程，並發表在了新一期的Emerging Microbes & Infections上。

事件還原：

2020年1月2日，從(cong) 兩(liang) 名患有非典型肺炎的患者中獲得了支氣管肺泡灌洗液（BALF）樣本。

2020年1月3日，進行SARS特異性RT PCR檢測，產(chan) 生部分RdRp片段，並揭示了潛在的病原體(ti) 。

2020年1月4日，擴展RdRp片段並獲得更多的基因組片段，並開始準備mNGS RNA文庫。

2020年1月5日，完成了mNGS RNA文庫的製備。

2020年1月6日，開始在Miseq平台上進行mNGS測序。

2020年1月7日, 接收測序數據，啟動病原體(ti) 鑒定流程，獲得病毒基因組，確定2019-nCoV為(wei) 病原體(ti) ，終的CoV基因組為(wei) 29,881 nt。

2020年1月8日, 進行基因組比較和進化分析。

自2020年1月3日起，即時進展報告已發送到中國疾病預防控製中心（CDC），在病原體(ti) 鑒定方麵取得的每個(ge) 進展保持同步。

和現在常用的核酸檢測手段——RT-PCR相比，NGS有著不可替代的顯著優(you) 勢。RNA-Seq可以檢測生物體(ti) 內(nei) 的“感染組”，如RNA病毒、DNA病毒、細菌、真核生物等，因為(wei) 除朊病毒外的病原體(ti) 都可以表達RNA。RNA-Seq不僅(jin) 可以檢測，而且還能揭示病原體(ti) 豐(feng) 度、變異情況、基因表達等信息。

目前，NCP病死率比較高的患者主要分為(wei) 兩(liang) 類：老年人和有基礎病的患者。有基礎病的患者感染2019-nCoV之後可能會(hui) 加重基礎病，例如繼發細菌感染，從(cong) 而使病情惡化。有些患者的免疫反應非常強，過激的炎症因子風暴非常危險。上一段中提到的RNA-Seq的優(you) 勢此時就能幫助醫療人員判斷病情，提供個(ge) 性化治療。

患者1為(wei) 39歲男性，患者2為(wei) 21歲女性。2名患者入院後接受了進行了影像學檢測，結果顯示，2名患者的肺部均可能發生了病毒感染。隨後的常規抗病毒和抗感染治療並未緩解其症狀。這之後，2名患者接受了常規病原檢測，均為(wei) 陰性。RT-PCR檢測顯示發現的病毒與(yu) SARS-Cov無關(guan) 。

在常規病原檢測的同時，研究者收集了2名患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF），從(cong) 中提取了總RNA，由於(yu) 總RNA濃度太低，低於(yu) Qubit核酸分析儀(yi) 定量0.5ng/ul的測量下限了，所以研究人員采用Nugen的Trio RNA-Seq微量樣本建庫試劑盒進行了文庫構建，並在MiSeq上進行PE150測序，在24 h內(nei) 各獲取了2名患者的7.34M和4.52M reads。測序數據顯示樣本中病毒的豐(feng) 度*：平均基因組覆蓋率分別為(wei) 523.6X和133.7X，估計的豐(feng) 度水平分別是患者1和2測序總序列的1.5％和0.62％。生物信息學分析發現，2名患者的幾乎全部病毒reads（分別為(wei) 99.9%和99.7%）都屬於(yu) 2019-nCoV。進一步分析發現，雖然數據中存在單核苷酸多態性（SNP），但2名患者所感染的是同一冠狀病毒，被分別命名為(wei) 2019-nCoV毒株WHU01和WHU02。

研究者在建庫階段采用了Nugen公司的Trio RNA-Seq建庫試劑盒，Trio整合了Nugen的三項技術：

• AnyDeplete技術，能夠定向去除人體宿主rRNA，提高信噪比,，減少背景序列幹擾。
• 單引物等溫擴增（SPIA） 技術，可以無偏倚地從有限和降解的樣品中擴增RNA。
• DimerFree技術，使建庫過程中不產生引物二聚體，文庫更高效、可靠。

在這項研究中，相比於(yu) 普通的RNA-Seq，Trio的*優(you) 勢極大地幫助了科研人員：

由於(yu) 使用AnyDeplete技術去除了人核糖體(ti) RNA（噪音），病毒reads（信號）所占比例大大提高，而且可以從(cong) 轉錄水平上與(yu) 宿主自身的RNA相比較。2名患者的2019-nCoV reads分別占測序總數據的1.5%和0.62%，豐(feng) 度非常高，超過了表達比較高的宿主基因，是2019-nCoV正在宿主肺部活躍複製的鐵證。

呼吸道疾病患者的BALF可能比較粘稠，富含蛋白質，而且來自2019-nCoV疑似病例的樣本要首先經過56°C、30 min滅活，才能進行後續的RNA提取。以上這些情況增加了RNA提取的難度，會(hui) 導致提取到的RNA量少、質量低。而Trio的SPIA技術可以無偏倚地從(cong) 有限和降解的樣品中擴增RNA，保證了後續建庫的成功率和轉錄豐(feng) 度的保真性。

參考文獻：

Liangjun Chen, Weiyong Liu, Qi Zhang, Ke Xu, Guangming Ye, Weichen Wu, Ziyong Sun, Fang Liu, Kailang Wu, Bo Zhong, Yi Mei, Wenxia Zhang, Yu Chen, Yirong Li, Mang Shi, Ke Lan & Yingle Liu (2020) RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak, Emerging Microbes & Infections, 9:1, 313-319, DOI: 10.1080/22221751.2020.1725399