牛呼吸道疾病（BRD）在兩(liang) 周到六個(ge) 月大的犢牛中很常見，是造成牛犢和飼養(yang) 場牲畜死亡的主要原因（Johnson等，2011； Larsen）等，1999； Virtala等，1999）。 BRD涉及多種病原，包括牛呼吸道合胞病毒（BRSV），牛冠狀病毒（BCoV），3型牛副流感病毒（BPI3），溶血性曼海姆氏菌，多殺巴斯德氏菌，索氏嗜血杆菌和牛支原體(ti) （Angen等，2009； Frisis和Krogh，1983；Kusiluka et al。，2000; Larsen et al。，1999; Tegtmeier等，1999）。 牛皰疹病毒1（BoHV-1）和牛病毒性腹瀉病（BVDV）也可以是致病的病原，但是這些病原已在包括丹麥在內(nei) 的多個(ge) 國家中被*。

在美國，超過90％的牧場會(hui) 受到BRD的影響，據報道在中大型澳大利亞(ya) 牧場中BRD的發生率為(wei) 18.2％（Hay等人，2014）。 2014年，丹麥奶牛的估計死亡率為(wei) 7-10％，而BRD被認為(wei) 是造成10-35％死亡的原因（Grønbæk等，2016）。在近的調查中，愛爾蘭(lan) 研究中10％的小牛死亡率歸因於(yu) BRD，英國的BRD患病率為(wei) 45.9％，發病率為(wei) 10.1％（Johnson等，2017）。可以通過幾種策略來控製BRD，例如正確使用初乳（Pardon等，2015）或接種疫苗計劃（Richeson等，2008）。抗生素在BRD治療和控製中的廣泛使用（De Briyne等人，2014）是抗生素在經濟動物中的主要用途之一（Fulton，2009； Nickell和White，2010）。 BRD是與(yu) 宿主易感性，環境條件，管理以及病原載量等多因素相關(guan) 。感染會(hui) 導致呼吸道發炎並損害呼吸道，嚴(yan) 重的會(hui) 導致死亡。發病機理被認為(wei) 是原發性病毒感染和隨後上皮細胞引起的細菌性繼發性感染（Angen等，2009; Sudaryatma等，2018）所致。病毒與(yu) 免疫係統的相互作用會(hui) 導致免疫抑製，從(cong) 而削弱宿主對繼發性細菌感染的免疫反應（Czuprynski等，2004）。 BRD的現場診斷基於(yu) 臨(lin) 床症狀，臨(lin) 床標本的微生物學診斷適合多種樣本，例如氣管抽吸液，鼻拭子和肺組織樣本。然而，通常會(hui) 遇到假陰性結果，因為(wei) 細菌可能是互相競爭(zheng) 或生長緩慢，並且可能其他細菌生長更快（Bell等人，2014; Kugadas等人，2014; Shanthalingam等人，2014; Tegtmeier等人，2000）。盡管經常使用諸如ELISA之類的血清學檢測方法來表明牛先前感染過牛分枝杆菌，但由於(yu) 血清產(chan) 生抗體(ti) 通常需要兩(liang) 周或更長時間，因此在早期感染中會(hui) 出現假陰性結果（Howard等人，1986; Petersen等人，2018）。已經開發出了廣泛的聚合酶鏈反應（PCR）分析方法來單獨測試BRD中涉及的每種病原（Amer等人，2013; Bell等人，2014; Klem等人，2019; Kishimoto等人（2017年； Rahpaya等人，2018年）。然而，對於(yu) 單一靶向PCR來分別檢測多種BRD病原成本非常昂貴。為(wei) 了克服這個(ge) 問題，近開發了一種多重PCR檢測方法（Zhang等，2017）。盡管個(ge) 別細菌或病毒可以單獨導致疾病，但混合性感染在BRD中常有放生。實現對這些病原的快速診斷對於(yu) 實施適當的治療和控製措施也至關(guan) 重要。常規PCR是有問題的，因為(wei) 在健康和患病的牛犢中都可能存在病原。在多種病原同時存在的情況下，臨(lin) 床標本中病原的定量檢測大大增加了微生物診斷的價(jia) 值（Lima等，2016； Pedersen等，2014，2013）。

近，發表了一種用於(yu) 檢測BRD相關(guan) 細菌病原體(ti) 的多重定量PCR（qPCR）方法，證明在與(yu) 兩(liang) 種或多種病原共感染時，其qPCR檢測性能優(you) 於(yu) 培養(yang) 方法（Loy等人，2018）。DNA Diagnostic A / S公司為(wei) 了提供一種可以快速檢測多種BRD病原方法，已經開發了Pneumo 4多重病原qPCR檢測方法。Pneumo 4檢測試劑盒分Pneumo 4B（細菌）和Pneumo 4V（病毒）兩(liang) 管檢測，可以分別快速地特異性地同時檢測和定量與(yu) BRD相關(guan) 聯的四種細菌（溶血性曼海姆氏菌，多殺巴斯德氏菌，睡眠嗜組織菌Histophilus somni，牛支原體(ti) ）和五種病毒（BPI3，BCoV，BRSV，BoHV-1和BVDV。對這9種病原的檢測可在同一反應條件下分2管PCR反應完成，與(yu) 並行運行的多個(ge) 單重qPCR分析相比，診斷實驗室在成本和處理時間方麵具有優(you) 勢。

Pneumo4B和Pneumo4V每次檢測分別能夠檢測10個(ge) 拷貝的基因組DNA和10-50個(ge) 拷貝的靶RNA，這與(yu) 以前建立的報告每個(ge) 反應100-250個(ge) 拷貝的方法具有可比性（Rahpaya等人，2018） 。 Pneumo4B檢測表明，許多氣管抽吸液（TA樣品）對溶血支原體(ti) ，多殺性巴氏杆菌或沙門氏菌PCR呈陽性，而通過培養(yang) 方法呈陰性。這些結果表明存在細菌，但由於(yu) 其培養(yang) 基的傾(qing) 向性或培養(yang) 中其他細菌過度生長而無法被檢測到（Bell等人，2014; Van Driessche等人，2017）。Pneumo4B的PCR方法可能會(hui) 克服伴隨的菌群的影響，並在傳(chuan) 統培養(yang) 失敗的混合樣本中檢測到病原（Loy et al，2018）。確定Pneumo4B的診斷特異性和敏感性時，必須考慮將培養(yang) 物作為(wei) 參考標準測定法的局限性。如果Pneumo4B正確地鑒定了培養(yang) 未檢測到的細菌種類，則Pneumo4B分析的特異性將被低估。如先前報道，少數樣品通過培養(yang) 對細菌呈陽性，而在Pneumo4B分析中呈陰性，證實qPCR可能導致假陰性結果，如先前報道（Bell et al，2014）。對此的解釋可能是引物/探針錯配，在儲(chu) 存或處理過程中核酸降解或在提取過程中出現技術錯誤。大多數培養(yang) 陽性/ PCR陰性樣品含有少量細菌，這可能是與(yu) 用於(yu) 培養(yang) 的較大體(ti) 積樣品相比，DNA提取樣品量較少的結果。但是，某些目標細菌可能在引物或探針識別位點具有序列變異。 PCR抑製劑也可能導致了這些結果，因為(wei) 我們(men) 發現一些培養(yang) 陽性/ PCR陰性的樣品來自內(nei) 部擴增對照（IAC）的PCR信號低得令人無法接受（無信號或Ct> 32），DNA提取物的5倍稀釋液並在重新測試後變為(wei) PCR陽性。但是，在我們(men) 的方法比較中，我們(men) 將此類樣品歸類為(wei) PCR陰性。與(yu) 參考方法相比，通過Pneumo 4B進行的牛支原體(ti) qPCR測試在氣管抽吸液（TA樣品）中檢測出更多陽性。我們(men) 不能排除Pneumo 4B可能與(yu) 其他支原體(ti) 物種發生交叉反應的情況，而在當前的研究中尚未對此進行測試。但是，在兩(liang) 種方法均為(wei) 陽性的樣品中，Pneumo4B的結果比標準PCR的結果低3–4 Ct值，這表明該檢測方法對牛支原體(ti) 的靈敏度比參考方法高。影響PCR擴增效率的因素有很多，例如樣品的存儲(chu) 和運輸和DNA提取方法差異（Bowman等，2016; Dilhari等，2017）。

DNA Diagnostic A / S公司采用經過國家獸(shou) 醫實驗室認可的丹麥單重分析qPCR病毒檢測方案作為(wei) 參考標準。與(yu) 這些標準方法相比，Pneumo 4V多重檢測的靈敏度相同或稍高。某些樣本在Pneumo4V PCR中對BPI3，BCoV或BRSV呈陽性，而在標準PCR中呈陰性。而隻有一例標準PCR呈陽性，而Pneumo4V呈陰性。這些陽性樣品的Ct值為(wei) 30以上。我們(men) 不能排除通過交叉汙染或與(yu) 本研究中未測試的其他病毒物種的非特異性擴增可能產(chan) 生高Ct的可能性。但是，丹麥養(yang) 殖場的樣本上驗證了Pneumo 4V的診斷敏感性和特異性有一個(ge) 限製，因為(wei) 丹麥沒有BoHV-1和BVDV病毒感染了。因此，無法評估BoHV-1和BVDV的診斷敏感性。在Pneumo 4V和標準PCR中，所有TA樣品的結果均確實對BoHV-1和BVDV陰性，表明在Pneumo 4V中對這兩(liang) 種病毒的檢測與(yu) 丹麥的其他牛呼吸道病毒沒有交叉反應。對於(yu) 在沒有BoHV-1 / BVDV的國家/地區常規使用，重要的是BoHV-1 / BVDV檢測方法必須具有高特異性，因為(wei) 假陽性檢測可能會(hui) 對監管和貿易產(chan) 生影響。需要進行其他研究以評估Pneumo 4V對含有BoHV-1和BVDV的臨(lin) 床樣品的敏感性。