PCR-RFLP 反應

PCR反應體(ti) 係:在 200ul離心管中進行，反應總體(ti) 積為(wei) 30ul， 反應體(ti) 係包括2XPCR預混液15ul,鑒別引物(30umol/L)各0.5ul,模板 l ul，無菌超純水13ul。將離心管置PCR儀(yi) ，PCR反應參數:95°C 預變性4分鍾，循環反應30次(95°C 30秒，55〜58°C ，72°C 3 0 秒 )，7 2 °C延 伸 5 分 鍾 。 取 P C R 反 應 液 ，置 500ul離心管中，進行酶切反應，反應總體(ti) 積為(wei) 20ul，反應體(ti) 係包括10X酶切緩衝(chong) 液2ul,PCR反應液6ul，Sma I(10U/M1) 0.5ul，無菌超純水11.5ul,酶切反應在30°C水浴反應2小 時。另取無菌超純水，同法上述PCR-RFLP反應操作，作為(wei) 空白對照。

電泳檢測照瓊脂糖凝膠電泳法(中國藥典2020年版通則0541)

膠濃度為(wei) 1.5%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed;供試品與(yu) 對照藥材 酶切反應溶液的上樣量分別為(wei) 8ul, DNA分子量標記上樣量為(wei) l ul (0.5ug/ul)。電泳結束後，取凝膠片在凝膠成像儀(yi) 上或紫外透射儀(yi) 上檢視。供試品凝膠電泳圖譜中，在與(yu) 對照藥材 凝膠電泳圖譜相應的位置上，在100〜250bp應有兩(liang) 條DNA 條帶，空白對照無條帶。